分子生物学检测手腕食物快手腕准绳食物前管造功课指点书食物分子生物学检测

　　差异检测本领所供给的结果拥有差异临床道理，撮合操纵可进一步降低病原学检测的灵活度和特异度， 更好的评释患者的病程发扬并举行诊疗监测。

　　2023年8月，由中国医学科学院北京协和病院检讨科徐英春教练、上海交通大学隶属瑞金病院呼吸与危重症医学科瞿介明教练为通讯作家揭晓了《成人呼吸道感导病原诊断核酸检测本领临床操纵专家共鸣（2023）》。

　　共鸣专家组由中华检讨医学培训工程专家委员会和中华医学会呼吸病学分会委员推选形成。2021年12月召开共鸣启动会，就共鸣症结性题目拟定提纲及义务分工，组筑共鸣执笔组、撰写专家组、评审专家组。共鸣执笔组以“呼吸道感导（respiratory tract infection）”“分子检测（molecular testing）”“分子诊断本领（molecular diagnostic tests）”为症结词，检索PubMed 、中国知网、万方数据常识效劳平台和维普数据库中的中、英文文件，经去重及阅读文件摘要和/或全文，共纳入55篇文件，变成共鸣。

　　分子诊断本领正在呼吸道感导性疾病，越发是环球应对新型冠状病毒大通行中，发扬了要紧效力，高灵活度和高特异度的核酸扩增试验（nucleic acid amplification tests ，NAATs）已成为诊断新冠病毒感导的参考模范。跟着基因组学、工程学和纳米科学等前沿学科的交叉协调急迅发扬，NAATs显现轶群种多样的检测伎俩和日初月异的本领伎俩，以 PCR为本原发扬出的及时荧光PCR、多重PCR、数字PCR和等温扩增本领，以及高通量测序、基因芯片、核酸质谱、生物传感器等检测本领，正在大型尝试室批量检测或现场核酸即时检测（point-of-care testing, POCT）中得以平常操纵。除呼吸道病毒表，少少编造还能检测细菌性肺炎的常见病原体及特定耐药基因。面临诸多检测伎俩，临床医师和微生物尝试室需留心鉴定何时选取何种伎俩或差异伎俩的组合，其断定身分囊括通行病学、尝试室资源、事情流程和检测本钱等（表2）。

　　及时荧光PCR本领是一种可对核酸举行定量的试验伎俩，其道理首假使通过及时搜聚荧光信号对核酸扩促举行监测。正在PCR扩增的指数功夫，模板的Ct值与其肇始拷贝数存正在线性干系，可实行对未知样本的定量检测。

　　要合用于门急诊、住院患者和大人群筛查，基于分子检讨平台举行病原体（囊括病毒、细菌、真菌、非典范病原体）的核酸检测，检测标本类型以鼻咽拭子、痰和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）为主。现有的商品化单靶标核酸检测病原体囊括：新型冠状病毒、鼻病毒、嗜肺军团菌、耶氏肺孢子菌等；多靶标核酸检测病原体囊括：呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、副流感病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核分枝杆菌等。

　　动作守旧的经典定量判辨伎俩，荧光探针法的灵活度和特异度显著优于底物发光法，但特异性引物探针的本钱和对仪器的央浼较高。其结果判读较为繁杂，须要对扩增弧线 职能验证央浼

　　定量检测需验证的职能目标囊括：准确度、细密度（囊括丈量反复性和丈量中心细密度）、不确定度、特异度（囊括抗搅扰本事）、灵活度、检出限、定量限、线性区间（可讲演区间）等。定性检测需验证的职能目标囊括：伎俩吻合率、检出限、抗搅扰本事、交叉响应等，详细职能目标以产物仿单央浼为准。

　　相较守旧 PCR 变温本领，等温扩增本领普通不须要变换响应温度，该本领计划多、本领道理不同较大，且各具上风，但根本道理仍是以特异性酶和引物举行扩增。等温扩增本领群多为指数扩增，目前多为定性检测。

　　首要合用于发烧门诊、急诊患者上呼吸道感导病毒（如新型冠状病毒、流感病毒等）及下呼吸道感导细菌（如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等）的急迅筛查。

　　等温扩增响应普通耗时短，扩增功用高，不须要 PCR 轮回仪且操作大略，但因为其本领的繁杂性，尚难以一切直接用于临床。

　　普通等温扩增为定性尝试，需满意中国及格评定国度认同委员会GL039定性尝试的验证央浼：吻合率≥90%；阴性和弱阳性样本细密度检测结果所有同等；参照厂门风明举行靶基因检测，5次反复检测应 100%检出，20次反复检测应检出起码18次。

　　数字PCR是一种不依赖于核酸表标的核酸绝对定量本领。其道理是通过微流控本领，将主意核酸和PCR 响应液散布正在多个响应单位内举行PCR 扩增，以液滴情势举行检测的式样也被称为微滴数字PCR。该本领通过检测扩增后每个响应单位的荧光信号强度，鉴定含有主意核酸的响应单位个数，基于泊疏松布揣度肇始样本中的主意核酸分子数，实行对核酸浓度的绝对定量。

　　可直接定量检测样本中病原体个数，希奇合用于低浓度样本、低品貌基因或突变基因的检测，也可动作质控伎俩评估其他分子检测产物的扩增功用。

　　无需模范弧线和模范品，可有用低落临床样本繁杂本底对扩增的搅扰， 拥有优越的重现性和确实度。其首要影响身分是PCR扩增和荧光信号判辨，前者与PCR扩增功用、扩增系统的装备相闭；后者与检测器的灵活度、核酸拷贝数、被支解成的物理单位数以及响应单位数相闭，响应单位数越多，灵活度越高。

　　应利用泊疏松布揣度靶标分子拷贝数，差异荧光通道之间应不存正在互相闭扰。定量检测职能目标应囊括：响应单位体积细密度、确实度、有用率；样本检测反复性、线性、动态范畴、灵活度。基于芯片的数字PCR芯片内应无气泡，阳性和阴性的随机散布应取得视觉确认。微滴数字PCR单次响应天生的最幼液滴数应吻合厂商创议或用户自界说值。

　　核酸即时检测为POCT本领中涉及核酸检测的一大类本领的总称，是核酸提取本领和分子扩增本领（囊括及时荧光PCR 、巢式 PCR、等温扩增、数字PCR等本领）的融和。其最大特色是将核酸的提取、扩增、检测均置于一个响应装备中，通过特定开发对扩增信号检测，完结对靶标核酸的筛查。目前核酸POCT首要以全自愿紧闭管造编造为主。

　　首要合用于发烧门诊、急诊、ICU和某些特定病区感导患者的病原体急迅检测。与守旧POCT差异，呼吸道病原体核酸POCT须要对检测病原的生物安笑举行评估。流感病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、百日咳杆菌等呼吸道病原体核酸 POCT 产物，已动作该类型代表产物问世。

　　核酸POCT的灵活度和特异度高于免疫学POCT，但其本钱较高。固然大个别核酸POCT产物为紧闭系统，但仍需防卫 PCR 污染的能够性。其余，其检测开发凡是较幼，便于带领，但也导致其通量较低，不对用于大人群筛查，满意大型病院临床检测需求往往须要装备多组开发。

　　定性检测职能验证目标起码囊括：吻合率≥90% ；阴性和弱阳性样本细密度检测结果所有同等；靶基因5次反复检测应100%检出，20次检测应起码检出18次。定量检测职能验证目标起码囊括：起码80%的样本结果偏倚正在±7.5%区间内；批内和批间细密度满意仿单范畴；线性区间满意仿单范畴；20次检测中≥18个检测结果与参考值之间的偏倚正在±7.5%区间内。

　　病原体高通量测序本领是采用高通量测序本领对临床标本中的核酸举行测序，通过与微生物参考基因组比对获取标本中的微生物物种构成、物种品貌等讯息。目前该本领首要分为三类：无偏倚检测的 mNGS、检测多浸痾原体及其耐药基因或毒力基因的tNGS 和获取某一种或多种病原体全基因组数据的高通量测序本领（whole-genome sequencing ，WGS）。

　　因为病原体高通量测序本领繁杂、结果解读难度大且价钱腾贵，创议遵照临床需求正在守旧微生物检测的本原上选取性利用，比如，需尽疾昭彰病原学诊断时、目前可及的微生物检讨伎俩无法昭彰诊断时、产生蚁集性呼吸道习染性病例需举行病原体溯源时。

　　病原体高通量测序本领可对标本中的核酸片断举行物种判决，但其物种、耐药基因和毒力基因判决确切实性受标本采样、尝试操作流程、病原体参考基因组数据库和生物讯息学判辨等多种身分影响。正在临床讲演的解读历程中，除深远判辨测序数据表，团结患者临床讯息及其他尝试室数据归纳鉴定和判别定植菌与仔肩病原体亦极端症结。

　　尝试室正在发展病原体高通量测序临床检测前，需参考尝试室自筑伎俩的联系央浼完结伎俩学设置和职能确认，团结预期临床用处确立预期职能目标，囊括：

　　急性上呼吸道感导是由种种病毒和/或细菌惹起的，首要进犯鼻、咽或喉部的一组急性感导性疾病，以病毒感导多见，如鼻病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、冠状病毒等，少数为细菌感导，以链球菌常见。临床症状不拥有特异性，多以上呼吸道卡他症状、咽部不适为临床出现，可伴发烧、头痛、咳嗽等其他症状。

　　需遵照疾病通行处境、患者病情重要水平、症状赓续岁月、兼并症处境、免疫造止状况评估结果、其他辅帮搜检结果的可参考性以及对预后的开头评判， 断定是否对疑似急性上呼吸道感导的上述患者举行检测。

　　正在通行危险高的季候，高危人群（暮年人、儿童、孕产妇、兼并本原疾病患者）举行流感病毒检测能够比履历性抗流感诊疗更经济。其余，急迅的结果反应（如2h内即出结果的急迅分子检测）可以缩短患者门急诊就诊岁月，低落流感传布危险，有利于流行症驾驭。

　　气管支气管炎指气管、支气管黏膜及其边际机闭的慢性非特异性炎症，常因病毒或细菌感导惹起该疾病加重。首要出现为永远咳嗽咳痰，伴/不伴呼吸贫苦等出现。该病临床特性特异性不强，常需与慢性窒息性肺疾病、支气管哮喘、支气管扩张症等疾病判别，此时需团结肺功用、胸部CT等搜检协帮诊断。

　　看待几次急性加重、发烧伴有脓痰、病情评估须要住院诊治的患者， 可琢磨细菌涂片或教育尽疾昭彰病原学以指挥抗生素操纵。

　　我国成人社区得到性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）常见病原体为肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等 ，近年筹议显示，病毒性肺炎正在成人CAP 中占比高达15.0%~34.9%，统一患者可同时兼并细菌、病毒、真菌等病原体感导。

　　重症CAP采纳死板通气诊疗的患者，若履历性诊疗无效，思疑有非常病原体感导，或经踊跃抗感导诊疗病情无好转，需与非感导性肺部病变判别，可经支气管镜留取下呼吸道标本举行病原学检测。肺炎兼并胸腔积液，越发是肺炎病灶同侧的胸腔积液可行胸穿举行胸水病原体检测。

　　CAP的致病菌教育往往耗时长，而苛养菌感导教育阳性率较低，所以核酸检测正在诊断CAP病原学方面拥有较大上风。若思疑为支原体、衣原体、军团菌、病毒等感导时，可采用血清特异性抗原、抗体检测撮合核酸检测和分散教育；及时荧光 PCR、等温扩增、数字PCR、高通量测序本领可同时检测多种病原体，供给病原体分型、毒力基因和耐药基因等深远判辨，若是临床方向于RNA病毒感导，创议选取RNA高通量测序。

　　病院得到性肺炎（hospital-acquired pneumonia, HAP）/呼吸机联系性肺炎（ventilator-associated pneumonia, VAP）是我国常见的病院得到性感导。爆发 HAP/VAP 后均匀住院岁月、抗感导诊疗疗程均延伸，且住院医疗用度扩充。我国 HAP/VAP常见病原菌囊括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等，耐药菌较为常见。

　　临床诊断HAP/VAP 后，应踊跃留取呼吸道、血液、胸腔积液标本行微生物学搜检。呼吸道标本应尽能够前辈行涂片镜检，再做病原体教育、抗原及核酸检测等。

　　非侵入性伎俩指经咳痰、鼻咽拭子、鼻咽吸收物或气管导管内吸引征采标本。侵入性伎俩指经支气管镜留取下呼吸道标本、经支气管镜或经皮肺穿刺活检留取机闭标本等。看待 HAP 患者，应先通过非侵入性伎俩留取呼吸道渗出物涂片及半定量教育，履历性诊疗无效、疑似非常病原菌感导或采用非侵入性伎俩获 得的呼吸道标本无法昭彰病原体时，再通过侵入性伎俩搜聚标本行微生物学搜检。

　　HAP/VAP患者常见病原体为细菌，病原学诊断以守旧教育为主，须要时可撮合多重PCR、微流控芯片等多靶标病原体核酸检测，无需旧例举行mNGS 。仅正在患者存正在免疫缺陷、3d内未通过守旧微生物学检测得到昭彰病原学凭借，且履历性抗感导诊疗无效时，琢磨举行以DNA检测为主的mNGS。

　　慢性窒息性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease ，AECOPD）是慢阻肺病程中的常见和要紧事项，普通被描写为有慢性窒息性肺疾病本原的患者产生呼吸道症状的急性恶化而导致出格诊疗。其首要症状是气促加重，常伴有咳嗽加剧、痰液渗出扩充和/或痰液性状变换，个别患者可伴有心悸、疲倦等不适，重要者可产生呼吸衰竭和/或心功用不全的临床出现。

　　这些症状均缺乏特异性，所以需与其他肺内疾病（如肺炎、肺栓 塞、气胸等）和肺表疾病（如心源性肺水肿、心律反常等）判别。下呼吸道细菌感导是AECOPD的常见出处，常见致病菌囊括流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌目细菌；相对少见的病原体囊括肺炎衣原体、肺炎支原体、军团菌、金黄色葡萄球菌等，鼻病毒等呼吸道病毒也是AECOPD的常见诱因。

　　肺是结核分枝杆菌进入人体的首要通道，结核分枝杆菌通过吸入惹起肺部感导。肺结核往往发扬从容，临床出现多样。肺结核的诊断并不大略，旧例尝试室搜检对其诊断帮帮有限，胸部影像学具相症结代价， 胸部CT比X线能供给更多有代价的细节。肺结核确切诊寄托细菌学搜检，抗酸染色对结核分枝杆菌的诊断至极要紧，但缺乏特异性，其他非结核分枝杆菌也可呈阳性；分枝杆菌教育是确诊伎俩。

　　核酸扩增本领可动作结核分枝杆菌急迅诊断伎俩。美国疾病防备驾驭核心创议对可疑营谋性结核的涂片抗酸染色阴性患者，起码举行一次呼吸道标本的结核分枝杆菌核酸检测。对涂片抗酸染色阳性患者，核酸扩增本领则可帮帮判别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。

　　对涂片阴性、教育阳性的结核患者，痰标本结核分枝杆菌核酸检测的灵活度和特异度别离为68%和96%。所以，一次核酸检测阴性结果不敷以摒除肺结核的诊断。

　　胸腔积液也是一种结核分枝杆菌感导的出现。结核性胸腔积液普通为渗透液并以淋巴细胞为主。胸水抗酸染色普通阴性，胸水结核分枝杆菌教育阳性率可达50%掌握 ，胸水的结核分枝杆菌核酸检测拥有高特异度和低灵活度。猛烈推选思疑结核性肋膜炎的患者采纳肋膜活检和胸水分枝杆菌教育。肋膜活检标本病理搜检和分枝杆菌教育撮合诊断率可达80% 。50%~97%的病例肋膜活检显示为肉芽肿， 40%~80%的病例分枝杆菌教育阳性。

　　结核特异性PCR与tNGS/mNGS对结核分枝杆菌的诊断本事宛如。与守旧伎俩比拟，tNGS/mNGS 比结核特异性PCR撮合检测更具上风，能明显改进结核和其他病原体的病原学诊断，tNGS检测可以供给结核耐药基因的帮帮。

　　免疫功用受损囊括原发和继发的免疫功用受损，好比人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus ，HIV）感导属于原发性免疫功用受损，肿瘤、 干细胞及实体和本身免疫性疾病永远利用糖皮质激素、免疫造止剂等属于继发免疫功用受损。除常见病原体表，结核分枝杆菌、诺卡氏菌、大幼胞病毒、 耶氏肺孢子菌、曲霉和隐球菌等时机性感导的几率更高，时机性病原体感导后症状与体征消失，越发HIV感导、患者爆发下呼吸道感导时病原学组成越发繁杂，前提致病菌、少见病原体、夹杂感导爆发的比例更高，此时患者病情更重、希望更疾速。可琢磨多种伎俩并行送检，临床常需踊跃发展涵盖主意病原体的多靶标核酸检测或mNGS以尽早诊断致病病原体。

　　正在履历诊疗的同时，应尽早发展支气管镜搜检及支气管肺泡灌洗举行囊括PCR或mNGS等正在内的病原体检测，裁汰初始履历性诊疗对病原学检测结果的影响。对BALF样本举行的其他微生物搜检项目取决于患者临床出现、影像学特性以及特定病原体感导的危境身分，举行囊括细菌涂片和教育、真菌涂片和教育、细胞学判辨、机闭病理学等正在内的病原学搜检。

　　对侵袭性真菌感导的高危患者，创议行真菌荧光染色、真菌教育、血清学、分子生物学乃至机闭病理学检测。越发线- β-D-葡聚糖（G试验）、隐球菌荚膜多糖抗原、血及 BALF标本曲霉半乳甘露聚糖（GM试验）撮合核酸检测，可降低真菌检出率；看待可能得到机闭病理学标本的患者也可行mNGS；如临床方向肺孢子菌感导，可采用呼吸道标本六胺银染色或PCR，撮合血清G试验，以昭彰鉴定，BALF及血标本mNGS也有帮于诊断，但PCR或mNGS肺孢子菌阳性不行分辨定植和感导，须要团结临床归纳鉴定。

　　免疫受损宿主肺部感导伴发菌血症的时机为5%~10%，显著高于免疫功用健康宿主，此类患者产生重症CAP时，可同时举行BALF及血标本mNGS ，以协帮昭彰能够的致病菌；血标本mNGS检测特异度略高于BALF ，灵活度低于BALF。

　　PCR本领拥有较高的灵活度及特异度，对发扬成有症状感导的诊断也有很 高的阴性吻合率， 已成为检测病毒感导的模范伎俩。越发推选正在造血干细胞及实 体后按期采用PCR伎俩举行病毒（囊括大幼胞病毒、EB 病毒和其他季候性通行呼吸道病毒）的动态检测。

　　成人呼吸道感导类型多样，差异感导类型及差异本原疾病患者病原谱各具特色，正在临床旧例诊疗历程中，应以患者临床症状体征为本原，撮合操纵影学、守旧微生物学、免疫学和分子生物学等检测本领（表3），凭借相应检测模范作出急迅、精准诊断。分子生物学诊断本领正在临床的操极目前仍有较多题目亟待管理，越发是对临床结果的准确解读。差异检测本领所供给的结果拥有差异临床道理，撮合操纵可进一步降低病原学检测的灵活度和特异度， 更好的评释患者的病程发扬并举行诊疗监测。